核(he)酸(suan)合成(cheng)儀(yi)是(shi)現(xian)代分子(zi)生物(wu)學(xue)、基因(yin)組學(xue)及生(sheng)物醫(yi)藥研發的(de)核(he)心(xin)裝(zhuang)備，它(ta)能(neng)夠(gou)在(zai)體(ti)外(wai)高(gao)效、精(jing)準(zhun)地(di)合(he)成(cheng)特定(ding)序(xu)列的(de)DNA或RNAoligonucleotide（寡核(he)苷(gan)酸）。其(qi)技(ji)術原(yuan)理融合了(le)固(gu)相(xiang)合成(cheng)技(ji)術、有(you)機化(hua)學(xue)與精(jing)密自動(dong)化(hua)控(kong)制，實現了對生命遺(yi)傳(chuan)密碼的(de)“按(an)需編寫(xie)”。
壹(yi)、核(he)心(xin)原(yuan)理：固(gu)相(xiang)磷酸(suan)亞胺(an)化(hua)學(xue)法(fa)
當前(qian)主流(liu)的(de)核(he)酸(suan)合成(cheng)技(ji)術均(jun)基(ji)於固(gu)相(xiang)合成(cheng)原(yuan)理，其(qi)核(he)心(xin)是(shi)磷酸(suan)亞胺(an)化(hua)學(xue)法(fa)。該方法(fa)具有(you)高(gao)效、高(gao)產(chan)率且(qie)易於自動(dong)化(hua)的(de)特(te)點(dian)，取(qu)代了(le)早(zao)期(qi)的(de)磷酸(suan)二酯(zhi)法(fa)和磷酸(suan)三酯(zhi)法(fa)。整個合(he)成(cheng)過程(cheng)在(zai)儀(yi)器的(de)合(he)成(cheng)柱內(nei)進行(xing)，目(mu)標(biao)鏈(lian)的(de)合(he)成(cheng)方向(xiang)是(shi)從3'端向(xiang)5'端。
合成(cheng)的(de)壹(yi)個(ge)循(xun)環主要包(bao)括(kuo)四(si)個(ge)基(ji)本(ben)步驟：
1.脫保護：
合(he)成(cheng)起(qi)始(shi)於共(gong)價連接在(zai)固(gu)相(xiang)載體(ti)上的(de)第(di)壹(yi)個(ge)核(he)苷(gan)酸。該核(he)苷(gan)酸的(de)5'-羥(qiang)基被(bei)保護基(ji)團所封閉(bi)。循(xun)環的(de)第(di)壹(yi)步是(shi)用(yong)酸溶液(ye)沖洗合成(cheng)柱，脫掉(diao)第壹(yi)個(ge)核(he)苷(gan)酸5'端的(de)DMT保護基(ji)，暴(bao)露(lu)出活性的(de)5'-羥(qiang)基，為下(xia)壹(yi)步偶聯(lian)反(fan)應(ying)做(zuo)好準備。脫下的(de)DMT陽離子(zi)呈(cheng)橙(cheng)色(se)，可通(tong)過光(guang)度法(fa)在(zai)線監測合成(cheng)效率(lv)。
2.活化(hua)與(yu)偶(ou)聯：
接下來，儀(yi)器將(jiang)下(xia)壹(yi)個(ge)要被連(lian)接(jie)的(de)核(he)苷(gan)酸單體(ti)和活化(hua)劑(ji)同(tong)時(shi)泵入(ru)合(he)成(cheng)柱。核(he)苷(gan)酸單體(ti)本(ben)身(shen)是(shi)高(gao)度活化(hua)的(de)，其(qi)3'端通(tong)過磷酸(suan)亞胺(an)基(ji)團(tuan)保護，5'端則(ze)由DMT保護，堿(jian)基上也(ye)有相(xiang)應(ying)的(de)保護基(ji)。
活化(hua)劑(ji)會激活核(he)苷(gan)酸單體(ti)的(de)3'磷酸(suan)亞胺(an)基(ji)團(tuan)，使(shi)其(qi)成(cheng)為壹(yi)個(ge)良好的(de)親(qin)電(dian)試(shi)劑(ji)。隨後，它(ta)迅(xun)速與(yu)固(gu)相(xiang)載體(ti)上已(yi)暴(bao)露(lu)的(de)5'-羥(qiang)基發生(sheng)親(qin)核(he)取(qu)代反(fan)應(ying)，形(xing)成(cheng)亞磷酸(suan)三酯(zhi)鍵，從而(er)將新的(de)核(he)苷(gan)酸加(jia)到(dao)正在(zai)延(yan)長(chang)的(de)寡(gua)核(he)苷(gan)酸鏈(lian)上。
3.蓋帽：
偶(ou)聯步驟並非(fei)100%有(you)效，總(zong)有(you)極(ji)少數鏈(lian)的(de)5'-羥(qiang)基未(wei)能(neng)參與反(fan)應(ying)。這(zhe)些失(shi)敗的(de)序(xu)列如(ru)果(guo)不被封(feng)閉(bi)，將(jiang)在(zai)後續循(xun)環中繼(ji)續參與反(fan)應(ying)，產(chan)生缺(que)失(shi)序(xu)列的(de)副(fu)產(chan)物。
“蓋(gai)帽”步驟使用(yong)兩(liang)種(zhong)試(shi)劑(ji)的(de)混(hun)合液(ye)對未反(fan)應(ying)的(de)5'-羥(qiang)基進(jin)行乙酰(xian)化(hua)封(feng)端，使其(qi)permanently失(shi)活。這些(xie)被(bei)“蓋帽”的(de)短鏈在(zai)最終(zhong)純(chun)化(hua)時(shi)會被去(qu)除，從而(er)極(ji)大提(ti)高最終(zhong)產(chan)物的(de)序(xu)列正確(que)性和純(chun)度(du)。
4.氧化(hua)：
上(shang)壹(yi)步偶聯(lian)形(xing)成(cheng)的(de)是(shi)不(bu)穩(wen)定(ding)的(de)亞(ya)磷酸(suan)三酯(zhi)鍵，容易被(bei)酸分解。本(ben)步通(tong)入(ru)碘(dian)/水/吡(bi)啶(ding)的(de)混(hun)合溶液(ye)，將其(qi)氧化(hua)成(cheng)更穩(wen)定(ding)的(de)磷酸(suan)三酯(zhi)鍵，從而(er)完(wan)成(cheng)壹(yi)個(ge)完(wan)整的(de)核(he)苷(gan)酸添(tian)加(jia)循(xun)環。
此後(hou)，儀(yi)器自(zi)動(dong)重(zhong)復上(shang)述(shu)“脫保護→偶(ou)聯→蓋帽→氧(yang)化(hua)”四(si)個(ge)步驟，每(mei)壹(yi)個(ge)循(xun)環添(tian)加(jia)壹(yi)個(ge)新的(de)核(he)苷(gan)酸，直至(zhi)整條(tiao)目(mu)標(biao)序(xu)列全(quan)部合(he)成(cheng)完(wan)畢(bi)。
二(er)、合成(cheng)後處(chu)理(li)
核(he)酸(suan)合成(cheng)儀(yi)完(wan)成(cheng)鏈的(de)組裝(zhuang)後(hou)，所得(de)產(chan)物仍(reng)是(shi)連(lian)接在(zai)固(gu)相(xiang)載體(ti)上且(qie)所有基團均被(bei)保護的(de)DNA粗(cu)品(pin)。因(yin)此需要後續處(chu)理(li)：
1.切(qie)割(ge)與脫(tuo)保護：使(shi)用濃(nong)氨(an)水(shui)溶液(ye)處(chu)理(li)，壹(yi)方面(mian)將(jiang)合成(cheng)的(de)寡(gua)核(he)苷(gan)酸鏈(lian)從CPG載體(ti)上切(qie)割(ge)下來，另壹(yi)方面(mian)同(tong)步移除所(suo)有堿(jian)基上的(de)保護基(ji)團和鏈末(mo)端的(de)DMT基(ji)團(tuan)。
2.純(chun)化(hua)：根(gen)據應(ying)用(yong)需求(qiu)，可通(tong)過高效液(ye)相色(se)譜（HPLC）或聚丙(bing)烯(xi)酰(xian)胺(an)凝膠(jiao)電泳(yong)（PAGE）等進行純(chun)化(hua)，以(yi)去(qu)除失(shi)敗序(xu)列和(he)副產(chan)物，得(de)到(dao)高(gao)純(chun)度(du)的(de)最終(zhong)產(chan)品(pin)。
三、總(zong)結(jie)
核(he)酸(suan)合成(cheng)儀(yi)的(de)本(ben)質(zhi)是(shi)壹(yi)臺(tai)高(gao)度自(zi)動(dong)化(hua)的(de)精(jing)密有機化(hua)學(xue)反(fan)應(ying)器。它(ta)通(tong)過將復(fu)雜(za)的(de)合(he)成(cheng)化(hua)學(xue)反(fan)應(ying)分解為壹(yi)系列可編(bian)程(cheng)控(kong)制的(de)標(biao)準(zhun)化(hua)步驟，並由(you)計算(suan)機精(jing)確(que)控(kong)制液(ye)體(ti)流(liu)速(su)、試(shi)劑(ji)用(yong)量和(he)反(fan)應(ying)時(shi)間，從而(er)實現(xian)了DNA/RNAoligonucleotide的(de)快(kuai)速(su)、高(gao)通(tong)量和(he)精(jing)準(zhun)合(he)成(cheng)。這壹(yi)技(ji)術的(de)成(cheng)熟與普(pu)及，極(ji)大地(di)推動(dong)了基因(yin)編輯(ji)、PCR檢測、核(he)酸(suan)藥物(wu)、DNA存儲等(deng)前沿(yan)科技(ji)的(de)飛速(su)發展。
