生(sheng)物藥(yao)電(dian)荷異構體(ti)分析難(nan)題(ti)如(ru)何破(po)？MauriceFlex +MS來(lai)解(jie)鎖(suo)！

在生物藥(yao)研發中，抗體(ti)的電(dian)荷異構體(ti)直接(jie)影響藥(yao)物療(liao)效與(yu)安全性。離(li)子(zi)交(jiao)換(huan)色譜(pu)（IEX）操作(zuo)繁(fan)瑣(suo)且(qie)分辨(bian)率(lv)有(you)限(xian)，傳(chuan)統(tong)的毛(mao)細(xi)管(guan)電(dian)泳-質譜(pu)聯(lian)用（CE-MS）常因(yin)高(gao)濃度(du)緩沖(chong)液與(yu)ESI不兼(jian)容，導(dao)致數據(ju)偏(pian)差。《Electrophoresis》期刊(kan)發布的(de)壹(yi)項研究利用(yong)MauriceFlex進(jin)行電(dian)荷異構體(ti)的快(kuai)速(su)分離(li)，並進(jin)行質譜(pu)分析，為(wei)這(zhe)壹(yi)難(nan)題(ti)提(ti)供(gong)了(le)高(gao)效的(de)解決方(fang)案。

研究以單克隆抗體(ti)Matuzumab為(wei)測試(shi)對象，通過MauriceFlex儀(yi)器(qi)實(shi)現(xian)了電(dian)荷異構體(ti)的快(kuai)速(su)分離(li)和(he)離(li)線質(zhi)譜(pu)分析。結(jie)果顯示，MauriceFlex不僅(jin)能夠(gou)高(gao)效地(di)分離(li)電(dian)荷異構體(ti)，還(hai)能與(yu)質譜(pu)無縫對接(jie)，提(ti)供(gong)高(gao)分辨(bian)率(lv)的(de)分析結(jie)果。這(zhe)種方(fang)法(fa)不(bu)僅(jin)克服了傳(chuan)統(tong)方(fang)法(fa)的(de)局限性，還(hai)顯著(zhu)提(ti)高(gao)了分析的(de)準(zhun)確性和(he)可(ke)靠(kao)性，為(wei)單克隆抗體(ti)的深(shen)層表征(zheng)提(ti)供(gong)了(le)全(quan)新的視角(jiao)。

01. 研究方(fang)法(fa)

(1) 毛(mao)細(xi)管(guan)等(deng)電(dian)聚焦電(dian)泳（icIEF）：使用(yong)MauriceFlex儀(yi)器(qi)進(jin)行icIEF分析，分為(wei)分析型(xing)和(he)制備型(xing)（餾(liu)分收集(ji)）兩(liang)種模式。分析型(xing)icIEF建(jian)立(li)基(ji)礎分離(li)條件，制備型(xing)icIEF通(tong)過增(zeng)加樣品(pin)濃度(du)和(he)添(tian)加精(jing)氨酸優化(hua)餾(liu)分收集(ji)，通過化學遷(qian)移技(ji)術將(jiang)電(dian)荷異構體(ti)餾(liu)分收集(ji)至(zhi)96孔板(ban)。

(2) 熒(ying)光(guang)檢(jian)測：通(tong)過熒光(guang)測量確(que)定(ding)96孔板(ban)中(zhong)含(han)有(you)蛋(dan)白質的(de)孔位(wei)。

(3) 質(zhi)譜(pu)分析（MS）：使用(yong)高(gao)分辨(bian)率(lv)質(zhi)譜(pu)儀(yi)對(dui)收(shou)集的(de)電(dian)荷異構體(ti)進行分析，解(jie)析其結(jie)構特(te)征。

(1) 方(fang)法(fa)適(shi)用性驗(yan)證

使用(yong)MauriceFlex儀(yi)器(qi)僅(jin)用1天完(wan)成(cheng)了從分析型(xing)cIEF轉化為(wei)制備型(xing)餾(liu)分收集(ji)的方(fang)法(fa)開發，並在2.5小時(shi)內完(wan)成(cheng)了高(gao)純度(du)電(dian)荷異構體(ti)餾(liu)分收集(ji)。結(jie)果發現(xian)分析型(xing)與(yu)制備型(xing)cIEF的(de)峰數量相同(tong)，方(fang)法(fa)轉化後(hou)分離(li)效果良好(hao)，表明從分析到(dao)制備的方(fang)法(fa)轉換(huan)可(ke)靠(kao)，為(wei)後續質(zhi)譜(pu)分析提(ti)供(gong)了(le)可(ke)靠(kao)的樣本(ben)。

圖(tu)1 Matuzumab的(de)分析型(xing)icIEF(上)與(yu)制備型(xing)icIEF餾(liu)分收集(ji)電(dian)泳圖(tu)(下(xia))對(dui)比(bi)

(2) 方(fang)法(fa)穩(wen)定(ding)性評估

為(wei)了評估餾(liu)分收集(ji)方(fang)法(fa)的(de)穩(wen)定(ding)性，將(jiang)Matuzumab樣品(pin)在(zai)制備型(xing)icIEF模式下獨立(li)收(shou)集(ji)三(san)次（Run1- Run 3），通過分析型(xing)icIEF對(dui)每次(ci)收(shou)集的(de)餾(liu)分進行驗證(zheng)（圖(tu)2），結(jie)果顯示各電(dian)荷異構體(ti)在不(bu)同(tong)分離(li)批(pi)次中(zhong)的峰形和(he)位(wei)置(zhi)高(gao)度(du)壹(yi)致，表明MauriceFlex制備型(xing)icIEF（餾(liu)分收集(ji)）具有(you)良(liang)好(hao)的(de)重現(xian)性和(he)準(zhun)確性。盡(jin)管三次(ci)實(shi)驗(yan)餾(liu)分在96孔板(ban)中(zhong)分布位(wei)置(zhi)存(cun)在(zai)微小偏(pian)移(yi)（1-2孔），但(dan)通(tong)過分析型(xing)icIEF驗(yan)證(zheng)可(ke)輕(qing)松匹配(pei)對(dui)應餾(liu)分，驗證(zheng)了餾(liu)分收集(ji)過程(cheng)的(de)穩(wen)定(ding)性。

圖(tu)2 Matuzumab樣品(pin)三(san)次餾(liu)分收集(ji)後的(de)分析型(xing)icIEF結(jie)果

(3) 質譜(pu)分析

使用(yong)高(gao)分辨(bian)率(lv)質(zhi)譜(pu)儀(yi)檢(jian)測未分離(li)的Matuzumab抗(kang)體(ti)和(he)經過MauriceFlex分離(li)的餾(liu)分，發現(xian)未分離(li)的樣品(pin)質(zhi)譜(pu)信號(hao)重疊(die)嚴(yan)重，而(er)經MauriceFlex分離(li)的餾(liu)分在質(zhi)譜(pu)圖(tu)上顯示出更清(qing)晰(xi)和(he)特(te)異的峰，表明MauriceFlex有(you)效(xiao)地(di)富(fu)集了特(te)定(ding)的(de)電(dian)荷異構體(ti)。通過質譜(pu)成(cheng)功鑒定(ding)了(le)包(bao)括(kuo)C末(mo)端(duan)賴氨酸異構體(ti)（K2、K1、K0）糖基(ji)化異構體(ti)（FA2和(he)A2G1），這(zhe)些(xie)發現(xian)對於理解單(dan)克隆抗體(ti)的結(jie)構和(he)功能具(ju)有(you)重要意(yi)義。研究還(hai)發現(xian)了壹(yi)些(xie)未報(bao)道過的酸性異構體(ti)，表明MauriceFlex餾(liu)分收集(ji)和(he)質譜(pu)的分析方(fang)法(fa)能(neng)有(you)效(xiao)揭(jie)示復雜電(dian)荷異構體(ti)的結(jie)構信(xin)息。

圖(tu)3 非(fei)分餾(liu)樣品(pin)（上）與(yu)icIEF餾(liu)分（下）的(de)質譜(pu)對比(bi)

作(zuo)者(zhe)以Matuzumab為(wei)測試(shi)對象，成(cheng)功開發了分析型(xing)icIEF方(fang)法(fa)，並(bing)快(kuai)速(su)轉化為(wei)制備型(xing)icIEF方(fang)法(fa)，2.5小時(shi)內完(wan)成(cheng)高(gao)純度(du)電(dian)荷異構體(ti)餾(liu)分收集(ji)，質譜(pu)分析則清(qing)晰(xi)揭(jie)示了包(bao)括(kuo)C末(mo)端(duan)賴氨酸異構體(ti)、糖基(ji)化異構體(ti)在內的(de)多(duo)種電(dian)荷異構體(ti)，甚至(zhi)發現(xian)了壹(yi)些(xie)未報(bao)道過的酸性物質。MauriceFlex+MS聯(lian)用方(fang)法(fa)不(bu)僅(jin)克服了傳(chuan)統(tong)方(fang)法(fa)的(de)局限性，還(hai)顯著(zhu)提(ti)高(gao)了分析的(de)分辨(bian)率(lv)和(he)準(zhun)確性，為(wei)單克隆抗體(ti)的深(shen)層表征(zheng)提(ti)供(gong)了(le)全(quan)新的視角(jiao)。

MauriceFlex全自(zi)動(dong)毛(mao)細(xi)管(guan)電(dian)泳分析與(yu)組分收集(ji)系統(tong)

* 參(can)考文(wen)獻：Wittmann, Antonia et al. Evaluation of a cIEF Fractionation Workflow for Offline MS Analysis of Charge Variants of the Monoclonal Antibody Matuzumab. Electrophoresis. 2025;46(3-4):240-249.

* 本(ben)文(wen)轉載(zai)自(zi)「ProteinSimple」微(wei)信(xin)公(gong)眾(zhong)號(hao)