應(ying)用(yong)於His標簽(qian)高(gao)效蛋(dan)白(bai)純化(hua)的(de)理(li)想註射(she)泵(beng)解(jie)決(jue)方案(an)

His標(biao)簽（多(duo)組氨酸標簽）是(shi)在(zai)變(bian)性(xing)條件下(xia)純(chun)化(hua)重組蛋(dan)白(bai)的(de)常用(yong)方(fang)案(an)。His標(biao)簽(qian)蛋(dan)白(bai)純化(hua)技(ji)術(shu)因(yin)其(qi)標簽(qian)分子(zi)量小、結(jie)構穩定且對目標(biao)蛋(dan)白(bai)功(gong)能(neng)、活(huo)性(xing)及構象(xiang)幹擾極(ji)小等(deng)優勢(shi)而(er)被(bei)廣泛應用。該(gai)技(ji)術(shu)通過基(ji)因(yin)工(gong)程(cheng)手段(duan)在(zai)目標(biao)蛋(dan)白(bai)N端融(rong)合(he)6個(ge)連(lian)續(xu)組氨酸殘基(ji)（6×His），基(ji)於固定(ding)化(hua)金屬(shu)離子(zi)親和(he)層(ceng)析(xi)（IMAC）原理(li)，使(shi)His標簽(qian)與(yu)固(gu)定化(hua)鎳/鈷離子(zi)通過穩定的(de)配(pei)位鍵(jian)特(te)異性(xing)結(jie)合(he)。

固(gu)定(ding)化(hua)金屬(shu)離子(zi)親和(he)層(ceng)析(xi)（IMAC）是純(chun)化(hua)組氨酸標簽蛋(dan)白(bai)的(de)常規(gui)方(fang)法。該(gai)方法采(cai)用含(han)有固(gu)定(ding)化(hua)金屬(shu)離子(zi)（如(ru)鈷離子(zi)，Co²⁺）的(de)IMAC介質(zhi)，通過金屬離子(zi)與His標簽的(de)配(pei)位結(jie)合(he)實現(xian)目的(de)蛋(dan)白(bai)的(de)捕獲(huo)。將介(jie)質(zhi)裝填(tian)至層析(xi)柱(zhu)後，以(yi)低(di)咪(mi)唑濃(nong)度(du)緩(huan)沖液作(zuo)為(wei)上(shang)樣(yang)緩(huan)沖(chong)液攜帶(dai)目標(biao)蛋(dan)白(bai)。控制緩沖(chong)液以(yi)低(di)流(liu)速緩(huan)慢流(liu)經層析(xi)柱(zhu)，使(shi)His標簽(qian)蛋(dan)白(bai)與介(jie)質中的(de)Co²⁺充(chong)分結合。然(ran)後(hou)采(cai)用高(gao)咪(mi)唑濃(nong)度(du)緩(huan)沖液通過競爭(zheng)性(xing)置(zhi)換(huan)將目的(de)蛋(dan)白(bai)洗脫回(hui)收(shou)。

這(zhe)種方(fang)法通過在(zai)固(gu)定化(hua)金屬(shu)離子(zi)親和(he)層(ceng)析(xi)柱(zhu)（IMAC column）中精(jing)確(que)控制變性(xing)緩(huan)沖(chong)液(ye)（如(ru)含(han)咪唑溶(rong)液(ye)）的(de)體(ti)積(ji)與流(liu)速，可實現(xian)組氨酸標簽蛋(dan)白(bai)的(de)穩定純(chun)化(hua)。純化(hua)過程的(de)控制越精(jing)確(que)，目標(biao)蛋(dan)白(bai)在(zai)單次(ci)柱(zhu)上(shang)操(cao)作(zuo)中的(de)回(hui)收(shou)率越(yue)高(gao)。采(cai)用可控且可重復的(de)IMAC純化(hua)流(liu)程(cheng)，研(yan)究(jiu)人員可在(zai)最(zui)短(duan)時(shi)間(jian)內獲(huo)得高(gao)純(chun)度(du)、高(gao)活(huo)性(xing)的(de)目標(biao)蛋(dan)白(bai)。

應用(yong)於His標(biao)簽高(gao)效蛋(dan)白(bai)純化(hua)的(de)理(li)想註射(she)泵(beng)解(jie)決(jue)方案(an)

許(xu)多(duo)實驗室致(zhi)力(li)於尋找(zhao)壹(yi)種經濟高(gao)效的(de)方法以(yi)實(shi)現(xian)高(gao)效的(de)蛋(dan)白(bai)質純(chun)化(hua)。壹(yi)種便(bian)捷的(de)方案(an)是(shi)通過鈷重(zhong)力(li)柱(zhu)以(yi)精(jing)確(que)可控的(de)方式(shi)輸(shu)送雙路獨(du)立(li)的(de)咪唑緩(huan)沖液進行(xing)可控洗脫，從(cong)而(er)實現(xian)對His標簽(qian)蛋(dan)白(bai)的(de)高(gao)效純(chun)化(hua)。針(zhen)對(dui)該(gai)應用的(de)理(li)想註射(she)泵(beng)解(jie)決(jue)方案(an)是(shi)通過I/O端口及內置(zhi)的(de)編程(cheng)功(gong)能(neng)，將(jiang)兩(liang)臺 Harvard Pump 11 Elite 可編程(cheng)註(zhu)射(she)泵(beng)進行(xing)聯(lian)用(yong)。此配(pei)置(zhi)可構建(jian)創(chuang)新(xin)性(xing)的(de)註射(she)泵(beng)系(xi)統，實(shi)現(xian)對兩臺(tai)註射(she)泵(beng)獨(du)立(li)流(liu)速的(de)同步(bu)控制。利用(yong)內置(zhi)的(de)多步(bu)驟(zhou)編程(cheng)及輸(shu)入(ru)/輸(shu)出(chu)信號通信(xin)功(gong)能(neng)，所有操(cao)作(zuo)均(jun)可通過Pump 11 Elite的(de)觸控界面(mian)完成(cheng)，無(wu)需外部(bu)編程(cheng)或(huo)計算(suan)機支持（見圖(tu)1）。

圖(tu)1

註(zhu)射(she)泵(beng)A：控制壹(yi)支 10 mL 氣(qi)密(mi)型註射(she)器(qi)，用於(yu)將(jiang)含(han)有His標(biao)簽(qian)蛋(dan)白(bai)的(de)低咪(mi)唑濃(nong)度(du)緩(huan)沖液以(yi) 1 mL/min 的(de)流(liu)速註(zhu)入重力(li)柱(zhu)，總體(ti)積(ji)為(wei)10 mL，持續(xu)10分鐘(zhong)。精(jing)確(que)控制流(liu)速對(dui)於確(que)保(bao)His標簽蛋(dan)白(bai)與柱(zhu)內鈷基(ji)IMAC介質充(chong)分結合至關重要(yao)。 

註射(she)泵(beng) B：控制壹(yi)支 10 mL 氣(qi)密(mi)型註射(she)器(qi)，用於(yu)輸(shu)送高(gao)咪(mi)唑濃(nong)度(du)緩(huan)沖液，用(yong)以(yi)將(jiang)結(jie)合(he)在(zai)鈷基(ji)親和(he)層(ceng)析(xi)介質(zhi)上(shang)的(de)標簽(qian)蛋(dan)白(bai)洗脫下(xia)來(lai)。

下(xia)壹(yi)步操(cao)作(zuo)要(yao)求 註(zhu)射(she)泵(beng) A 進入(ru)回(hui)抽模(mo)式以(yi)完(wan)成(cheng)灌註。註射(she)泵(beng) A 向註射(she)泵(beng) B 發(fa)送信(xin)號，讓(rang)註(zhu)射(she)泵(beng) B 通過其註射(she)器(qi)吸入高(gao)咪(mi)唑濃(nong)度(du)緩(huan)沖液。從(cong)註(zhu)射(she)模(mo)式切(qie)換(huan)至回(hui)抽模(mo)式所產生(sheng)的(de)壓力(li)變化(hua)將觸發(fa)單向閥開啟(qi)，從(cong)而(er)使(shi)兩臺(tai)泵(beng)均(jun)能充(chong)滿(man)合(he)適(shi)濃(nong)度(du)的(de)咪唑緩(huan)沖液。回(hui)抽過程需迅(xun)速但可控，以(yi)避免緩沖液發(fa)生(sheng)脫氣(qi)現(xian)象(xiang)。緩沖(chong)液壹(yi)旦脫氣(qi)，將(jiang)對(dui)重(zhong)力(li)柱(zhu)中鈷基(ji)介質上(shang)的(de)蛋(dan)白(bai)純化(hua)反應(ying)產生(sheng)不利影響(xiang)。

當兩個(ge)註射(she)器(qi)均完(wan)成(cheng)裝(zhuang)填後，註(zhu)射(she)泵(beng)A 和(he) 註(zhu)射(she)泵(beng)B 將(jiang)同時(shi)按(an)照(zhao)預設的(de)流(liu)量程序運行(xing)：

註(zhu)射(she)泵(beng)A：輸(shu)送低(di)咪(mi)唑濃(nong)度(du)緩(huan)沖液，初(chu)始(shi)流(liu)速為(wei) 1mL/min，經20分鐘(zhong)後(hou)遞(di)減(jian)至(zhi)0 ml/min（見圖(tu)2）。

註(zhu)射(she)泵(beng)B：輸(shu)送高(gao)咪(mi)唑濃(nong)度(du)緩(huan)沖液，初(chu)始(shi)流(liu)速為(wei) 0mL/min，經20分鐘(zhong)後(hou)遞(di)增至(zhi)1mL/min（見圖(tu)3）。

圖(tu)2 (左(zuo))  & 圖(tu)3 (右(you))

通過雙泵協(xie)同控制，鈷重(zhong)力(li)柱(zhu)內的(de)總流(liu)速在(zai)梯度(du)運(yun)行期(qi)間(jian)始(shi)終維(wei)持在(zai)1mL/min，這(zhe)樣的(de)流(liu)速既(ji)能(neng)保(bao)證標簽(qian)蛋(dan)白(bai)的(de)有效洗(xi)脫，又(you)可避免對重力(li)柱(zhu)超壓（見圖(tu)4）。

圖(tu)4