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86-021-52261560
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01. 研(yan)究背景(jing)
(1) 研(yan)究問(wen)題(ti)：這篇文(wen)章(zhang)主(zhu)要(yao)探(tan)討(tao)了(le)使(shi)用(yong)MaxCyte流(liu)式電穿(chuan)孔技(ji)術(shu)進(jin)行病(bing)毒載(zai)體(ti)（包(bao)括(kuo)腺相(xiang)關(guan)病(bing)毒和慢病(bing)毒）生(sheng)產(chan)的方(fang)法和效率。
(2) 研(yan)究難(nan)點：傳統(tong)的病(bing)毒載(zai)體(ti)生(sheng)產(chan)技(ji)術(shu)勞(lao)動(dong)密集、步驟(zhou)多且(qie)效率低，難以滿足(zu)大(da)規(gui)模生(sheng)產(chan)的需求(qiu)。
(3) 相(xiang)關(guan)工作：MaxCyte的流式(shi)電穿(chuan)孔技(ji)術(shu)作(zuo)為(wei)壹種(zhong)通(tong)用(yong)的瞬時轉(zhuan)染平(ping)臺(tai)，旨(zhi)在(zai)解決(jue)病(bing)毒載(zai)體(ti)生(sheng)產(chan)的諸多(duo)問(wen)題。
02. 研究方(fang)法
提(ti)出了(le)使(shi)用(yong)MaxCyte流(liu)式電穿(chuan)孔技(ji)術(shu)進(jin)行病(bing)毒載(zai)體(ti)生(sheng)產(chan)的方(fang)法。具體(ti)來(lai)說(shuo)包(bao)括(kuo)：
(1) 細(xi)胞類型：該(gai)技(ji)術(shu)適(shi)用(yong)於(yu)貼壁(bi)細(xi)胞和懸(xuan)浮細(xi)胞。
(2) 多(duo)質(zhi)粒(li)共轉染：MaxCyte系(xi)統(tong)可(ke)以同時(shi)轉(zhuan)染多(duo)個質粒(li)，包(bao)括(kuo)大質(zhi)粒(li)，從而(er)制(zhi)造(zao)復(fu)雜的病(bing)毒載(zai)體(ti)。
(3) 可(ke)擴展性：MaxCyte系統(tong)在(zai)不同規(gui)模的細(xi)胞培養(yang)中(zhong)表現(xian)出(chu)壹(yi)致(zhi)的高轉(zhuan)染(ran)效率和細(xi)胞活(huo)力(li)。
03. 實驗設(she)計
(1) 大規(gui)模慢病(bing)毒生(sheng)產(chan)：在(zai)貼(tie)壁(bi)HEK細(xi)胞中(zhong)使用(yong)MaxCyte STX進(jin)行四質(zhi)粒(li)共轉染。
• HEK 293FT細(xi)胞在(zai)轉(zhuan)染前2-3天(tian)在(zai)10層細(xi)胞工廠中(zhong)接種(zhong)。
• 使(shi)用(yong)流(liu)式電穿(chuan)孔技(ji)術(shu)進(jin)行共轉染，每(mei)天(tian)收(shou)集培養(yang)基並(bing)測(ce)量轉導單位。
(2) 懸(xuan)浮細(xi)胞中(zhong)的慢病(bing)毒生(sheng)產(chan)：懸(xuan)浮適(shi)應的HEK 293FT細(xi)胞在(zai)10L Wave Cellbags中(zhong)培養(yang)，通(tong)過(guo)流(liu)式(shi)電(dian)穿(chuan)孔技(ji)術(shu)轉(zhuan)染(ran)慢病(bing)毒組(zu)件質粒(li)。
• 轉染後(hou)的細(xi)胞被返回(hui)Cellbags中(zhong)。
• 在GMP合(he)規(gui)的核心設(she)施中(zhong)進行3次生(sheng)產(chan)運行，每次運行均顯(xian)示出(chu)高滴(di)度(du)。
(3) 不(bu)同規(gui)模下的慢病(bing)毒生(sheng)產(chan)壹(yi)致(zhi)性：通(tong)過(guo)靜(jing)態(tai)電(dian)穿(chuan)孔和流(liu)式(shi)電穿(chuan)孔（使用(yong)MaxCyte）。
• 測(ce)量轉染(ran)後(hou)48小時的慢病(bing)毒滴(di)度(du)，結(jie)果顯(xian)示無論規(gui)模大(da)小，生(sheng)產(chan)力(li)壹(yi)致(zhi)。
(4) 高效的高滴(di)度(du)AAV生(sheng)產(chan)：在(zai)貼(tie)壁(bi)HEK細(xi)胞中(zhong)使用(yong)MaxCyte STX進(jin)行三(san)質粒(li)共轉染。
• 轉(zhuan)染(ran)後(hou)48小時，幾(ji)乎100%的轉染(ran)細(xi)胞表現(xian)出(chu)強(qiang)勁(jin)的轉基因表達。
• 通(tong)過(guo)qPCR分(fen)析測(ce)量細(xi)胞沈(chen)澱中(zhong)的高滴(di)度(du)AAV。
04. 結(jie)果與分析
(1) 大(da)規(gui)模慢病(bing)毒生(sheng)產(chan)：在(zai)貼(tie)壁(bi)HEK細(xi)胞中(zhong)，使用(yong)MaxCyte STX進(jin)行四質(zhi)粒(li)共轉染，每(mei)天(tian)收(shou)集培養(yang)基並(bing)測(ce)量轉導單位，結果顯(xian)示高效的生(sheng)產(chan)能(neng)力(li)。
(2) 懸(xuan)浮細(xi)胞中(zhong)的慢病(bing)毒生(sheng)產(chan)：在(zai)懸(xuan)浮適(shi)應的HEK 293FT細(xi)胞中(zhong)，使用(yong)MaxCyte系(xi)統(tong)進(jin)行生(sheng)產(chan)，3次生(sheng)產(chan)運行均顯(xian)示出(chu)高滴(di)度(du)，表明(ming)該(gai)技(ji)術(shu)在(zai)懸(xuan)浮細(xi)胞中(zhong)的可(ke)擴展性和壹(yi)致(zhi)性。
(3) 不(bu)同規(gui)模下的慢病(bing)毒生(sheng)產(chan)壹(yi)致(zhi)性：通(tong)過(guo)靜(jing)態(tai)和流(liu)式(shi)電穿(chuan)孔在HEK細(xi)胞中(zhong)生(sheng)產(chan)慢病(bing)毒，結(jie)果顯(xian)示無論規(gui)模大(da)小，生(sheng)產(chan)力(li)壹(yi)致(zhi)。
(4) 高效的高滴(di)度(du)AAV生(sheng)產(chan)：在(zai)貼(tie)壁(bi)HEK細(xi)胞中(zhong)，使用(yong)MaxCyte STX進(jin)行三(san)質粒(li)共轉染，結(jie)果顯(xian)示幾(ji)乎100%的轉染(ran)細(xi)胞表現(xian)出(chu)強(qiang)勁(jin)的轉基因表達，並(bing)且(qie)通(tong)過(guo)qPCR分(fen)析測(ce)量到(dao)高滴(di)度(du)的AAV。
總(zong)體(ti)結(jie)論
MaxCyte的可(ke)擴展電穿(chuan)孔技(ji)術(shu)允(yun)許對(dui)貼(tie)壁(bi)和懸(xuan)浮適(shi)應細(xi)胞進(jin)行高效轉染(ran)。該(gai)技(ji)術(shu)能(neng)夠(gou)共轉染多(duo)個質粒(li)和大(da)質(zhi)粒(li)，制(zhi)造(zao)復(fu)雜的病(bing)毒載(zai)體(ti)。MaxCyte轉(zhuan)染過(guo)程(cheng)的壹致(zhi)性使(shi)得無論培養(yang)規(gui)模如(ru)何，生(sheng)產(chan)產(chan)量(liang)都具有壹致(zhi)性。高效的懸(xuan)浮細(xi)胞轉(zhuan)染(ran)簡化(hua)了(le)使(shi)用(yong)MaxCyte過(guo)程(cheng)進行病(bing)毒載(zai)體(ti)制(zhi)造(zao)的可(ke)擴展性。通(tong)過(guo)MaxCyte電(dian)穿(chuan)孔技(ji)術(shu)生(sheng)成(cheng)的高滴(di)度(du)AAV展(zhan)示了(le)該(gai)技(ji)術(shu)在(zai)制(zhi)造(zao)應(ying)用(yong)中(zhong)的多樣(yang)性(xing)。
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