Simple Western 助力(li)您的通(tong)用(yong)型(xing)iPSCs的基(ji)因治療之路(lu)

01. 什麽是通(tong)用(yong)型(xing)iPSCs？

通用(yong)型(xing)誘導(dao)多(duo)能(neng)幹細(xi)胞(bao)（iPSCs）是指(zhi)經(jing)過(guo)基(ji)因編(bian)輯處理(li)，能(neng)夠降低免疫原性(xing)、避免(mian)免(mian)疫識(shi)別與(yu)攻擊(ji)，從而可(ke)適用(yong)於(yu)異(yi)體(ti)移植(zhi)的誘導(dao)多(duo)能(neng)幹細(xi)胞(bao)。此(ci)類細(xi)胞(bao)在異(yi)體(ti)移植(zhi)場(chang)景(jing)中不會引(yin)發(fa)免(mian)疫排(pai)斥(chi)反應(ying)，具有“現成"可(ke)用(yong)、經(jing)濟(ji)高效的特(te)點(dian)，能(neng)夠為大規模(mo)臨(lin)床應(ying)用(yong)提(ti)供(gong)適(shi)合的細(xi)胞(bao)來(lai)源，推動(dong)再(zai)生(sheng)醫(yi)學及基(ji)因治療技(ji)術的發(fa)展。

人(ren)類白(bai)細(xi)胞(bao)抗原（HLA）是細(xi)胞(bao)表(biao)面(mian)的關(guan)鍵(jian)分(fen)子(zi)，免(mian)疫系統(tong)通(tong)過(guo)其來(lai)區分(fen)自(zi)身和(he)非自(zi)身細(xi)胞(bao)。在異(yi)體(ti)移植(zhi)中，供(gong)體(ti)與(yu)受者的HLA不匹配會引(yin)發(fa)免(mian)疫排(pai)斥(chi)反應(ying)。通用(yong)型(xing)iPSCs的構建(jian)需要(yao)對(dui)HLA分(fen)子(zi)進(jin)行(xing)基(ji)因編(bian)輯，以減(jian)少(shao)或消除HLA的表(biao)達(da)，從而避免(mian)免(mian)疫系統(tong)的識(shi)別與(yu)攻擊(ji)。然而(er)，HLA分(fen)子(zi)分(fen)為I類和(he)II類，占(zhan)據基(ji)因組的較大區域(yu)，難以通過(guo)單(dan)壹基(ji)因編(bian)輯策(ce)略刪(shan)除。研(yan)究(jiu)發(fa)現(xian)，敲(qiao)除β₂微球蛋(dan)白(bai)（β₂M）亞基(ji)可(ke)以有效(xiao)抑制HLA-I類分(fen)子(zi)的表(biao)達(da)²，而(er)敲(qiao)除CIITA轉錄(lu)因子(zi)能(neng)夠抑制HLA-II類分(fen)子(zi)的表(biao)達(da)³。通(tong)過(guo)聯(lian)合敲(qiao)除這兩(liang)種基(ji)因，可(ke)以實(shi)現iPSCs中HLA分(fen)子(zi)的全(quan)面(mian)抑制。

然而(er)，HLA-I類分(fen)子(zi)的缺(que)失(shi)會導(dao)致(zhi)自(zi)然殺(sha)傷(shang)（NK）細(xi)胞(bao)的攻(gong)擊(ji)性顯(xian)著增強，因為NK細胞(bao)通(tong)過(guo)識(shi)別HLA-I類分(fen)子(zi)上(shang)的特(te)定(ding)配體(ti)來(lai)判斷細胞(bao)是否(fou)正常。為了(le)逃(tao)逸NK細(xi)胞(bao)的攻(gong)擊(ji)，部(bu)分(fen)研(yan)究(jiu)嘗(chang)試僅(jin)保(bao)留(liu)HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G等亞(ya)類分(fen)子(zi)^4,5，但(dan)這樣(yang)的iPSCs仍(reng)然無(wu)法避免(mian)免(mian)疫排(pai)斥(chi)反應(ying)，僅能(neng)視為“半(ban)通用(yong)"細(xi)胞(bao)。因此(ci)，構建(jian)通(tong)用(yong)型(xing)iPSCs的關(guan)鍵(jian)挑戰(zhan)在於有(you)效(xiao)地防止NK細胞(bao)的攻(gong)擊(ji)¹。近期的研(yan)究(jiu)進(jin)展表(biao)明，通(tong)過(guo)抑制NK細胞(bao)激活(huo)受(shou)體(ti)（KAR）的配(pei)體(ti)表達(da)，例(li)如(ru)敲(qiao)除CD155基(ji)因並(bing)保(bao)留(liu)HLA-E分(fen)子(zi)，可(ke)以使(shi)iPSCs在逃逸NK細(xi)胞(bao)識(shi)別的同(tong)時，仍(reng)然保(bao)留(liu)對(dui)腫(zhong)瘤細胞(bao)的抑制能力(li)6。然而(er)，NK細(xi)胞(bao)通(tong)過(guo)多(duo)種(zhong)KAR與(yu)不同(tong)的配(pei)體(ti)結合(he)，且配(pei)體(ti)表達(da)水(shui)平(ping)會因細(xi)胞(bao)類型(xing)而異(yi)，這增加了(le)通(tong)用(yong)型(xing)iPSCs構建(jian)的復(fu)雜(za)性。

02. 蛋(dan)白(bai)表達(da)篩(shai)選(xuan)驗證基(ji)因敲(qiao)除或敲(qiao)低(di)的蛋(dan)白(bai)編碼(ma)序(xu)列(lie)

流式(shi)細胞(bao)術和(he)ELISA在檢測(ce)細胞(bao)內(nei)蛋(dan)白(bai)時存(cun)在局限(xian)性(xing)，傳(chuan)統(tong)Western Blot耗(hao)時且重(zhong)復(fu)性(xing)差(cha)。相比之下，Simple Western技(ji)術的Jess平(ping)臺(tai)能高效檢(jian)測(ce)膜結合(he)蛋(dan)白(bai)及細(xi)胞(bao)內(nei)靶標蛋(dan)白(bai)，僅需3 µL iPSCs裂(lie)解(jie)液(ye)即(ji)可(ke)實(shi)現可(ke)重(zhong)復(fu)定(ding)量(liang)分(fen)析，並可(ke)用(yong)於(yu)篩(shai)選(xuan)殘(can)留(liu)Cas9蛋(dan)白(bai)，保障(zhang)工程化iPSCs的安(an)全(quan)性。

利用(yong)CRISPR-Cas9基(ji)因編(bian)輯技(ji)術創(chuang)建(jian)了(le)靶(ba)向(xiang) HLA和(he)KAR配體的基(ji)因敲(qiao)除文庫（表(biao)1）。

表(biao) 1 iPSCs 中的基(ji)因敲(qiao)低(di)靶(ba)標。β₂M和(he)CIITA敲(qiao)除分(fen)別抑制HLA-1和HLA-2；BAT3、CD155和(he)MICA為已(yi)知KAR配(pei)體。CIITA和BAT3為胞(bao)內(nei)定(ding)位，其余(yu)為表面暴(bao)露(lu)靶(ba)點(dian)。

圖 2  Simple Western 篩(shai)選(xuan)KAR配體(ti)敲(qiao)除iPSCs克(ke)隆(long)。RePlex™ 模(mo)塊用(yong)於(yu)在探針 1（左）中同(tong)時檢(jian)測(ce) BAT3、CD155 和 MICA，在探針 2（右）中通(tong)過(guo)化(hua)學發(fa)光(guang)檢(jian)測(ce)總蛋(dan)白(bai)。

圖3 顯(xian)示的是以野生(sheng)型(xing)為對(dui)照，量(liang)化各(ge)克(ke)隆(long)的敲(qiao)低(di)百分(fen)比，並(bing)將流(liu)式(shi)與(yu)Simple Western 進(jin)行(xing)對(dui)比(bi)。

Simple Western顯(xian)示多(duo)數(shu)克(ke)隆(long)的靶(ba)點(dian)敲(qiao)低(di)率(lv)高於流(liu)式(shi)（圖3，表(biao)2）。克(ke)隆(long)#7對(dui)5個(ge)靶(ba)點(dian)的敲(qiao)低(di)具有良好效(xiao)果(guo)（除BAT3為69%外，其余(yu)均(jun)低於(yu)野生型(xing)50%）。

表 2 Knockdown of intracellular targets that were unreliably detected by flow cytometry were measured by the Simple Western platform. 數(shu)值表示(shi)相對(dui)於(yu)野生(sheng)型(xing)對(dui)照的百分(fen)比表(biao)達(da)量(liang)（野生(sheng)型(xing)表達(da)量(liang)設(she)為100%，敲(qiao)低(di)為0%）

03. 殘(can)留(liu)Cas9篩(shai)選(xuan)

CRISPR-Cas9工程化iPSCs需監測(ce)殘(can)留(liu)Cas9，Simple Western檢測(ce)顯示所(suo)有克(ke)隆(long)的Cas9均(jun)低(di)於6.4 ng/mL重(zhong)組對(dui)照（圖4）

圖(tu) 4 Simple Western 篩(shai)選(xuan)工程 iPSCs 中的殘(can)留(liu) Cas9

經(jing)基(ji)因改(gai)造(zao)成為通用(yong)低(di)免(mian)疫原性(xing)供(gong)體(ti)的iPSCs需在蛋(dan)白(bai)質水(shui)平(ping)進(jin)行(xing)功能(neng)驗(yan)證。在此環(huan)節中，Simple Western技(ji)術相比於傳(chuan)統(tong)蛋(dan)白(bai)質分(fen)析方(fang)法，在以下幾個(ge)方(fang)面展現(xian)出它的優(you)勢(shi)：

(1) Simple Western儀器(qi)可(ke)無(wu)差別(bie)檢(jian)測(ce)全細胞(bao)裂(lie)解(jie)液(ye)、表面(mian)蛋(dan)白(bai)及純化(hua)蛋(dan)白(bai)，全程僅需3小(xiao)時且無(wu)需人(ren)工(gong)操作。

(2) 傳(chuan)統(tong)Western blot方(fang)法可(ke)輕松轉移至Simple Western平臺(tai)。作為毛細(xi)管(guan)電泳免(mian)疫分(fen)析，其提(ti)供(gong)尺(chi)寸(cun)特(te)異(yi)性(xing)及抗體靶向檢(jian)測(ce)，已(yi)驗證抗體超(chao)5,000種(zhong)。

(3) Simple Western檢測(ce)僅需 3 μL 微(wei)量(liang)樣本, 無(wu)需延(yan)長(chang)細胞(bao)培(pei)養(yang)。

(4) Simple Western具有高重(zhong)復(fu)性(xing)、高靈敏度(du)及定(ding)量(liang)分(fen)析功能(neng)。作(zuo)為開放式(shi)毛細(xi)管(guan)Western blot技(ji)術平(ping)臺(tai)，Simple Western用(yong)戶(hu)可(ke)自(zi)由選(xuan)用(yong)任何(he)商(shang)業化或定(ding)制抗體，實(shi)現對(dui)目(mu)標蛋(dan)白(bai)及其異(yi)構體的特(te)異(yi)性(xing)檢(jian)測(ce)。

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* 本文轉載自(zi)「ProteinSimple」微信(xin)公(gong)眾號

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