動(dong)態(tai)高速濕轉儀(yi)是(shi)Western Blot實(shi)驗(yan)中實(shi)現(xian)蛋白(bai)質從(cong)凝膠高效轉印到(dao)膜(mo)上的關鍵(jian)設備(bei)，其操作(zuo)流程直接(jie)影(ying)響(xiang)實(shi)驗(yan)結果(guo)的(de)準(zhun)確(que)性(xing)和重復(fu)性(xing)。以(yi)下(xia)為標準(zhun)化操作(zuo)步驟(zhou)：
壹、設備(bei)安(an)裝與(yu)調(tiao)試
設備(bei)檢(jian)查
確認儀(yi)器(qi)外(wai)觀無損(sun)壞(huai)，電(dian)源線、轉膜夾、海(hai)綿(mian)墊、濾紙等(deng)配件齊全。
檢查轉膜槽(cao)密(mi)封(feng)性(xing)，確(que)保(bao)無漏(lou)液風險(xian)。
安裝位(wei)置
將(jiang)儀(yi)器(qi)放置(zhi)於平穩操作(zuo)臺，遠(yuan)離(li)熱源和振(zhen)動(dong)源(yuan)。
確保通風良好(hao)，避(bi)免設備(bei)過(guo)熱。
電(dian)氣連接(jie)
連接(jie)電(dian)源線，檢查電(dian)壓是否符合設備(bei)要求(qiu)(通(tong)常(chang)為220V)。
開啟(qi)電(dian)源，觀察(cha)儀(yi)器(qi)自檢(jian)是否正常(chang)。
參數預(yu)設
根(gen)據實(shi)驗(yan)需求(qiu)設置(zhi)轉膜參數(如(ru)電(dian)壓、電(dian)流、時間(jian))。
推薦參數：
電(dian)壓：100-250V(根據凝(ning)膠厚(hou)度(du)調(tiao)整(zheng))
時間(jian)：10-15分鐘(動(dong)態(tai)高速濕轉儀(yi)可縮(suo)短(duan)至(zhi)傳(chuan)統時間的1/5)
溫度(du)：4℃(需預(yu)冷轉膜液)
二(er)、實(shi)驗(yan)前準(zhun)備(bei)
凝膠制(zhi)備(bei)
完成(cheng)SDS-PAGE電(dian)泳(yong)，取出(chu)凝膠並(bing)切(qie)除(chu)濃縮(suo)膠。
將(jiang)分離(li)膠浸(jin)入轉膜液中平(ping)衡(heng)5-10分鐘。
膜(mo)處(chu)理(li)
根(gen)據實(shi)驗(yan)需求(qiu)選(xuan)擇(ze)PVDF膜(mo)或(huo)NC膜。
PVDF膜(mo)需用(yong)甲(jia)醇(chun)激(ji)活(huo)15秒，再(zai)浸(jin)入轉膜液中平(ping)衡(heng)。
濾紙與(yu)海(hai)綿(mian)準(zhun)備(bei)
裁剪(jian)與(yu)凝(ning)膠大(da)小(xiao)匹配的濾紙(6.5×10cm)和海(hai)綿(mian)墊。
將濾紙和海(hai)綿(mian)浸入轉膜液中充(chong)分潤濕。
三(san)、轉膜操(cao)作(zuo)
組(zu)裝“三(san)明治”結構(gou)
陰極(黑色面)：海(hai)綿(mian)墊 → 濾紙 → 凝(ning)膠 → 膜(mo) → 濾紙 → 海(hai)綿(mian)墊
陽極(紅(hong)色(se)面)：覆蓋後閉(bi)合轉膜夾，確(que)保(bao)無氣泡(pao)。
安裝轉膜夾
將(jiang)轉膜夾插入轉膜槽(cao)，黑色面對黑色電(dian)極，紅(hong)色(se)面對紅色電(dian)極。
加(jia)入預(yu)冷轉膜液至標記線，避(bi)免液面過(guo)高導致短(duan)路(lu)。
啟(qi)動(dong)轉膜
蓋(gai)上轉膜槽(cao)蓋子(zi)，連接(jie)冰盒或(huo)循環水冷(leng)裝置。
按下(xia)啟(qi)動(dong)按鈕，開(kai)始(shi)轉膜。
四、實驗優(you)化與(yu)註(zhu)意事(shi)項(xiang)
溫度(du)控制(zhi)
轉膜過(guo)程(cheng)中持(chi)續(xu)冰浴，防(fang)止溫度(du)過(guo)高導致蛋白(bai)質降(jiang)解。
動(dong)態(tai)高速濕轉儀(yi)通(tong)過(guo)內(nei)置冷(leng)卻系(xi)統(tong)或(huo)外(wai)接冰盒維(wei)持(chi)低(di)溫。
氣泡(pao)排(pai)除(chu)
用玻璃棒或(huo)滾輪輕輕(qing)趕走(zou)凝(ning)膠與(yu)膜(mo)之間的(de)氣(qi)泡(pao)。
氣泡會(hui)導(dao)致(zhi)轉膜不均勻，影響(xiang)結果(guo)。
參數調(tiao)整(zheng)
凝膠厚(hou)度(du)：0.75mm凝膠用(yong)100V，1.5mm凝膠用(yong)150V。
轉膜時(shi)間(jian)：根據目(mu)標蛋白(bai)分子(zi)量調(tiao)整(zheng)(如(ru)小(xiao)分子(zi)蛋白(bai)可縮(suo)短(duan)至(zhi)7分鐘)。
電(dian)流監(jian)測(ce)
動(dong)態(tai)高速濕轉儀(yi)通(tong)過(guo)實(shi)時(shi)電(dian)流反饋(kui)優(you)化轉膜效(xiao)率。
若電(dian)流異常(chang)(如(ru)過(guo)高或過(guo)低(di))，需檢(jian)查電(dian)路或轉膜夾連接(jie)。
五(wu)、轉膜後(hou)處(chu)理(li)
膜(mo)的(de)取出(chu)
轉膜結束後，打開(kai)轉膜夾，將(jiang)膜(mo)浸入麗(li)春紅(hong)S染液中染色(se)5分鐘。
根(gen)據條帶清晰度(du)判斷(duan)轉膜效(xiao)果(guo)。
封閉(bi)與(yu)孵育(yu)
將膜(mo)浸(jin)入5%脫脂(zhi)牛奶(nai)中封(feng)閉(bi)2小時(shi)。
壹抗(kang)孵育(yu)(4℃過(guo)夜(ye))→ 二(er)抗(kang)孵育(yu)(室溫1小時(shi))。
顯(xian)影(ying)
使(shi)用ECL發(fa)光(guang)液顯(xian)影(ying)，通過(guo)化學發(fa)光(guang)成(cheng)像系(xi)統(tong)采(cai)集(ji)圖像。
六、設備(bei)維(wei)護(hu)與(yu)故(gu)障排(pai)除(chu)
日常(chang)維護(hu)
每(mei)次使(shi)用後(hou)清潔轉膜槽(cao)，避(bi)免鹽(yan)結晶。
定(ding)期檢查電(dian)極和密(mi)封(feng)圈(quan)，更(geng)換老(lao)化部(bu)件(jian)。
常(chang)見故(gu)障
漏(lou)液：檢查密(mi)封(feng)圈(quan)是(shi)否損(sun)壞(huai)或轉膜夾是(shi)否閉(bi)合緊(jin)密(mi)。
電(dian)流異常(chang)：檢查電(dian)源線、電(dian)極連接(jie)及轉膜液導電(dian)性(xing)。
轉膜不均：重新檢查“三(san)明治”結構(gou)組(zu)裝和氣泡排(pai)除(chu)。
總結
動(dong)態(tai)高速濕轉儀(yi)通(tong)過(guo)優(you)化轉膜參數和溫度(du)控制(zhi)，顯(xian)著(zhu)縮(suo)短(duan)轉膜時(shi)間(jian)並提高效率。嚴(yan)格(ge)遵循標準(zhun)化操作(zuo)流程，結合實驗優(you)化技巧(qiao)，可確保(bao)Western Blot實驗結果(guo)的(de)穩定(ding)性(xing)和重復(fu)性(xing)。
