Pala, 助力(li)單B細(xi)胞分(fen)離(li)及(ji)聯合(he)測序(xu)

單細(xi)胞RNA測序(xu)（scRNA-seq）作(zuo)為(wei)壹(yi)種高通(tong)量測序(xu)技術(shu)，它允許(xu)研究者(zhe)在(zai)單個細(xi)胞水平上(shang)測量基(ji)因表達，揭(jie)示(shi)細(xi)胞群(qun)體(ti)內部的異質性(xing)，識(shi)別不(bu)同(tong)細(xi)胞類(lei)型或狀(zhuang)態(tai)的基(ji)因表達模式，為(wei)細(xi)胞生物(wu)學(xue)、發育生物(wu)學(xue)、疾病研究和(he)藥(yao)物(wu)發現等領(ling)域(yu)的(de)研究提(ti)供(gong)了(le)新的維度和(he)深(shen)度。

單細(xi)胞RNA測序(xu)技術(shu)起始(shi)於(yu)單細(xi)胞分(fen)離(li)，Bio-Techne單細(xi)胞柔(rou)性(xing)系(xi)統(tong)Pala為(wei)單細(xi)胞分(fen)選(xuan)提(ti)供(gong)了(le)快(kuai)速便捷的途(tu)徑(jing)。以下(xia)實驗通過(guo)單細(xi)胞柔(rou)性(xing)分(fen)選系統(tong)Pala分(fen)選經細(xi)胞活(huo)性染(ran)料及(ji)特異(yi)性(xing)熒(ying)光抗體(ti)標記的單個活(huo)化B細(xi)胞。通(tong)過(guo)對靜(jing)息及(ji)活(huo)化B細(xi)胞基(ji)因表達分析研究活(huo)化對基(ji)因表達的影響(xiang)。

實驗步驟(zhou)

（1）利(li)用mCD40L-3T3飼養細(xi)胞對人(ren)原(yuan)代(dai)記(ji)憶B細(xi)胞活(huo)化6天(tian)。收集活(huo)化後細(xi)胞並(bing)用(yong)抗人(ren)CD27-PE抗體(ti)及(ji)細(xi)胞活(huo)性染(ran)料CellTrackerGreen進(jin)行(xing)染(ran)色(se)。

（2）在(zai)板中(zhong)加入(ru)每(mei)孔(kong)4微升(sheng)裂解(jie)液(ye)，利用單細(xi)胞柔(rou)性(xing)分(fen)選系統(tong)Pala將(jiang)PE及(ji)FITC陽(yang)性(xing)細(xi)胞分(fen)選(xuan)至96孔PCR板中(zhong)。細(xi)胞裂解(jie)後進(jin)行(xing)cDNA合(he)成及(ji)RNA建(jian)庫測序(xu)。

（3）每(mei)孔(kong)中(zhong)進(jin)行(xing)VH及(ji)VL抗體(ti)可(ke)變(bian)區基(ji)因特異(yi)性(xing)擴(kuo)增（qPCR）。

（4）基(ji)因文(wen)庫利用(yong)Illumina Nextseq進(jin)行(xing)測序(xu)，比較(jiao)活(huo)化及(ji)靜(jing)息狀(zhuang)態(tai)下(xia)B細(xi)胞的(de)基(ji)因表達差異。

實驗結(jie)果(guo)

（1）單細(xi)胞分(fen)離(li)效率：經過(guo)擴增(zeng)後，96孔中(zhong)有(you)93孔含(han)有(you)cDNA（97%）。

（2）單細(xi)胞驗證：Sanger測序(xu)表明所(suo)有(you)的孔(kong)中(zhong)都(dou)是單個細(xi)胞，不(bu)存在(zai)二聚(ju)體(ti)的情(qing)況。

（3）免(mian)疫球蛋(dan)白基(ji)因表達：免(mian)疫球蛋(dan)白qPCR結(jie)果(guo)顯示(shi)所(suo)有(you)所(suo)有(you)樣品中(zhong)均(jun)表達重鏈IGVH，輕(qing)鏈僅(jin)表達kappa或lambda（IGVK、IGVL）中(zhong)的壹(yi)種(zhong)。